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encapsula含DC膽固醇的陽離子脂質(zhì)體列表

 更新時間:2021-03-10 點擊量:1355

 

encapsula含DC膽固醇的陽離子脂質(zhì)體列表

(Genesome®)(普通和熒光)

 

尺寸貨號脂質(zhì)組成價格數(shù)量小計
2毫升GEN-7027DC-Chol:DOPE(1:1)$ 750.00
$ 0.00
2毫升GEN-7028DC-Chol:DOPE(1:2)$ 750.00
$ 0.00
2毫升GEN-7029含0.5%NBD-DOPE(熒光)的DC-Chol:DOPE(1:1)$ 850.00
$ 0.00
2毫升GEN-7030含0.5%Rhod-PE(熒光)的DC-Chol:DOPE(1:1)$ 850.00
$ 0.00
2毫升GEN-7031含0.5%NBD-DOPE(熒光)的DC-Chol:DOPE(1:2)$ 850.00
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2毫升GEN-7032含0.5%Rhod-PE(熒光)的DC-Chol:DOPE(1:2)$ 850.00
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購物車總計 $ 0.00

描述

陽離子脂質(zhì)體傳統(tǒng)上用于傳遞遺傳物質(zhì),例如各種類型的DNA(pDNA,cDNA,CpG DNA,寡核苷酸,反義寡核苷酸),各種類型的RNA(例如siRNA,mRNA)和核酸酸模擬物(NAM)。 將DNA封裝到常規(guī)的中性帶電荷的基于PC的脂質(zhì)體中可能是一個技術(shù)問題,主要是由于質(zhì)粒的大小。由于這個問題在80年代后期,已經(jīng)開發(fā)了由陽離子脂質(zhì)和PE組成的脂質(zhì)體。這個想法是用陽離子脂質(zhì)的正電荷中和pDNA的負電荷,以便主要由于靜電相互作用有效地捕獲更多質(zhì)粒并將其傳遞到細胞中。通常,該程序僅基于將陽離子脂質(zhì)體與DNA或RNA混合并將其添加到細胞中即可。這導致骨料的配方。 

為了設(shè)計合適的陽離子脂質(zhì)用于基因傳遞,已將兩種方法用于陽離子脂質(zhì)合成:1)基于膽固醇的設(shè)計,例如DC-膽固醇和GL-67脂質(zhì),以及2)非基于膽固醇的設(shè)計,例如作為DOTAB,DDAB和DOTMA。 為了使用脂質(zhì)體在體外成功轉(zhuǎn)移基因應(yīng)考慮一些因素:  i)結(jié)合和包裝脂質(zhì)體中DNA / RNA的能力; ii)包裝的DNA / RNA與細胞表面的相互作用; iii)DNA / RNA內(nèi)在化的效率; iv)萬一發(fā)生內(nèi)吞作用,從內(nèi)體釋放細胞內(nèi)DNA; v)細胞核中的轉(zhuǎn)基因表達水平。 已根據(jù)其在酸性條件下釋放其含量的趨勢設(shè)計了對pH敏感的脂質(zhì)體。主要概念基于病毒,該病毒通過pH 5-6的蛋白質(zhì)與內(nèi)體膜融合,并在到達溶酶體之前將其遺傳物質(zhì)傳遞到細胞質(zhì)中。 通常,pH敏感脂質(zhì)體由二油?;字R掖及罚―OPE)組成。由于磷脂酰乙醇胺(PE)在酸性條件下會發(fā)生變化,因此據(jù)信它可以充當膜融合促進劑。 脂質(zhì)體與細胞之間相互作用的有效性高度依賴于脂質(zhì)體組合物。脂質(zhì)體通過各種內(nèi)吞過程捕獲,效率取決于細胞類型和脂質(zhì)體大小。各種大小和電荷的脂質(zhì)體可通過吞噬作用附著于巨噬細胞和嗜中性粒細胞。脂質(zhì)體附著到細胞表面后,由于早期內(nèi)體的酸性更高(6.50),內(nèi)化進入內(nèi)體。通過成熟或囊泡融合將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到酸性更高的pH(5.5-6.0)的后一個內(nèi)體,這需要10-15分鐘。攝取后二十分鐘(或更長時間),內(nèi)含物被遞送至pH 5.0或更低的溶酶體。溶酶體是內(nèi)吞途徑中主要的降解和后的內(nèi)吞區(qū)段,pH不敏感的脂質(zhì)體在其中積累和降解。但是,在pH敏感脂質(zhì)體滲透到細胞中后,不會發(fā)生積累和降解。

下載產(chǎn)品說明書 下載安全數(shù)據(jù)表(SDS)

配方信息

含DC膽固醇的陽離子脂質(zhì)體(Genesome®)(普通和熒光)

有關(guān)上述脂質(zhì)體脂質(zhì)組成的更多信息,請單擊此處。

緩沖液和脂質(zhì)體大小規(guī)格
緩沖去離子無核糖核酸水
pH值7
脂質(zhì)體大小100納米

熒光陽離子脂質(zhì)體的熒光染料

熒光染料激發(fā)/發(fā)射(nm)分子結(jié)構(gòu)
1,2-二油?;?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基)(銨鹽)460/535
1,2-二油?;?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(lissamine羅丹明B磺?;ㄤ@鹽)560/583

氮/磷(N / P)比

基于陽離子胺氮(在陽離子脂質(zhì)中)和DNA磷酸基團濃度計算正負電荷之比。DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它們通過磷酸二酯鍵(一種特定類型的共價鍵)結(jié)合在一起,該磷酸二酯鍵可以長到數(shù)百萬個核苷酸。由于存在構(gòu)成每個核苷酸的磷酸根基團(戊糖+含氮堿基+磷酸根),DNA和RNA帶負電。當形成磷酸二酯鍵的一部分時,它們保留2個負電荷中的1個。失去另一個負電荷以形成與新戊糖的另一個酯鍵。這就是將該鍵稱為“磷酸二酯”的原因。例如,陽離子脂質(zhì)DC-膽固醇具有以下結(jié)構(gòu)。

DC-膽固醇具有兩個氮原子,但是靠近羧基的氮不是帶正電的。DC-膽固醇僅包含一個可質(zhì)子化的氮原子。因此,每個分子有一個正電荷。1 nmol的DC-膽固醇可貢獻1 nmol的正電荷。對于其他脂質(zhì),請查看其分子結(jié)構(gòu)以找到分子中的氮原子數(shù)。

siRNA脂質(zhì)體

RNA與DNA不同,是單鏈分子。但是,siRNA是雙鏈的例如,在一個長21 bp的siRNA分子中,由于堿基對中有2個核苷酸,并且每個核苷酸帶有一個負電荷,因此存在42個負電荷。

siRNA堿基對

DNA電荷計算

µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負電的磷酸鹽。

陽離子脂質(zhì)-魚精蛋白-DNA(LPD)復合物

魚精蛋白是一種高度帶正電荷的聚陽離子肽,分子量為5.1 kDa,可作為DNA縮合試劑。已知魚精蛋白是精子核中用于濃縮DNA的主要成分。所有魚精蛋白都含有精氨酸,并且是強堿性的(等電點= 11-12)。
由脂質(zhì)魚精蛋白-DNA(LPD)組成的脂質(zhì)多聚體是通過魚精蛋白預壓縮的DNA與陽離子脂質(zhì)體的結(jié)合而產(chǎn)生的。這與通過陽離子脂質(zhì)和DNA之間直接靜電相互作用形成的陽離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)復合物相反。脂質(zhì)魚精蛋白-DNA具有凈正表面電荷,據(jù)信對于其與陰離子細胞表面蛋白聚糖的結(jié)合是*的。細胞表面的這種靜電相互作用觸發(fā)脂質(zhì)-DNA復合物的內(nèi)吞作用進入細胞。

向DNA和陽離子脂質(zhì)體中添加魚精蛋白的順序非常重要。一種方案涉及將質(zhì)粒DNA與硫酸魚精蛋白預復合,然后添加陽離子脂質(zhì)體。該協(xié)議有兩個缺點。其中之一是需要大量過量的陽離子脂質(zhì)才能實現(xiàn)大水平的基因表達。通常,陽離子脂質(zhì)/ DNA摩爾比必須大于35,才能有效體內(nèi)轉(zhuǎn)染。另一個問題是難以制備濃縮樣品。這是由于魚精蛋白硫酸鹽與質(zhì)粒DNA的強烈相互作用,這使得高濃度魚精蛋白/ DNA復合物的制備變得困難,尤其是在需要高魚精蛋白/ DNA比(w / w)的情況下。為了解決這些問題,已經(jīng)開發(fā)了第二種方案,其中將硫酸魚精蛋白與陽離子脂質(zhì)體混合,然后添加質(zhì)粒DNA。由于陽離子脂質(zhì)體和魚精蛋白之間競爭與質(zhì)粒DNA的相互作用,大大降低了魚精蛋白和DNA之間的強相互作用。在一定條件下,這將導致形成平均直徑小于150 nm的LPD。

為了計算正負比率,您需要考慮:

  • 1 mol的魚精蛋白硫酸鹽貢獻21 mol的正電荷(硫酸魚精蛋白的MW約為5.1 kDa)。
  • 1 nmol的單陽離子脂質(zhì)有助于1 nmol的正電荷。
  • µg DNA可產(chǎn)生3.1 nmol帶負電的磷酸鹽。

Lipoplex的插入后PEG化

聚乙二醇化已在脂質(zhì)體學領(lǐng)域廣泛使用了數(shù)十年。聚乙二醇化的好處是*的,包括改善脂質(zhì)復合體的系統(tǒng)循環(huán)。然而,脂質(zhì)復合體的PEG化的缺點也已經(jīng)被很好地證明。這包括防止脂質(zhì)復合物與靶細胞締合以及抑制DNA從內(nèi)體區(qū)室釋放,這導致非常低的轉(zhuǎn)染效率。

隨著摻入陽離子脂質(zhì)體中的PEG化脂質(zhì)的分子量增加,陽離子脂質(zhì)體的細胞毒性增加。例如,含有PEG5000的脂復合物比含有PEG2000的脂復合物更具細胞毒性。陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染活性隨PEG-DSPE脂質(zhì)百分比的增加而降低。先前的研究表明,添加0.5%,1%和2%的PEG-PE分別將其活性降低至肺部原始熒光素酶活性的60%,40%和10%。還已經(jīng)報道將PEG-PE(1%的陽離子脂質(zhì))添加到新形成的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物中可以防止復合物在儲存期間聚集。但是,將含有PEG-PE的復合物在4°C下儲存會緩慢恢復其原始活性。一般來說,聚乙二醇化不用于轉(zhuǎn)染實驗。但是,特別是在某些實驗中體內(nèi)實驗使用聚乙二醇化脂復合物。

如果您需要進行涉及陽離子脂質(zhì)體聚乙二醇化的實驗,則強烈建議先將適量的遺傳物質(zhì)添加到脂質(zhì)體中,然后再在外部添加聚乙二醇化脂質(zhì)(插入后)并孵育脂質(zhì)體,以形成脂質(zhì)復合物。然后將PEG脂質(zhì)在高于陽離子脂質(zhì)的液相到凝膠相變溫度的溫度下放置一小時(如果是不飽和陽離子脂質(zhì),例如DOTAP,則可以在室溫下孵育)。

在許多實驗中,由于不使用傳統(tǒng)的PEG2000-DSPE,而是使用C8-PEG2000-神經(jīng)酰胺對脂質(zhì)復合物進行PEG化,因為PEG-神經(jīng)酰胺是一種“脫落的PEG”,在與生物膜接觸時會從脂質(zhì)復合物中擴散出去。

細胞活力測定

由于脂質(zhì)體制劑中使用的陽離子脂質(zhì)具有細胞毒性,因此強烈建議進行細胞生存力分析。可以通過改良的Alamar藍分析法評估細胞活力。阿拉瑪藍含有氧化還原指示劑,該指示劑在細胞代謝的氧化還原范圍內(nèi)均顯示熒光變化。簡而言之,將10μL的10%(v / v)Alamar藍色染料添加到100μL樣品中。在37ºC下孵育2小時后,在熒光分光光度計上在570 nm和600 nm上讀取所得的熒光。使用以下公式計算細胞生存力(對照細胞的百分比)

 

技術(shù)說明

  • Genesome® 產(chǎn)品是使用無去離子RNAse的水配制的。
  • N / P比是指氮磷比。N代表氮,而不是負,并且氮帶正電。P代表磷酸鹽,不是正值。磷酸鹽帶有負電荷。因此,N / P比也代表正負比。一些陽離子脂質(zhì)含有一個以上的氮,但并非所有的氮原子都帶有正電荷。例如,DC-膽固醇具有兩個氮原子,并且其中只有一個帶正電。羧基旁邊的氮不是帶正電荷的,因此不應(yīng)該包括在N / P計算中。
  • 細胞毒性也可以按照制造商的說明使用CytoTox96®非放射性細胞毒性測定法(Promega,麥迪遜,威斯康星州)進行評估。
  • 脂質(zhì)體應(yīng)保持在4°C且切勿冷凍。

外貌

PlainGenesome®是由納米級單層脂質(zhì)體制成的白色半透明液體。FluorescentGenesome®制劑帶有顏色,其顏色取決于所用熒光染料的類型(有關(guān)外觀,請參見SDS)。通常由于脂質(zhì)體小,在小瓶底部不會發(fā)生沉淀。將脂質(zhì)體包裝在琥珀色的小瓶中。 

 

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