trialtusbioscience CL7 / Im7蛋白純化體系說明書
CL7 / Im7蛋白純化系統(tǒng)基于兩個小蛋白（CL7和Im7）之間形成的超高親和力復合物。CL7（16kDa）是與靶蛋白融合的標簽，Im7（10 kDa）是與瓊脂糖樹脂偶聯(lián)的配體。
CL7的野生型是CE7 DNase，一種有毒的細菌蛋白。突變被設計成消除其DNA結合和DNAse活性，同時保留了對Im7的超高親和力。
CL7標簽可以在靶蛋白的N或C末端表達。我們的質粒提供了溶解度標簽，親和標簽和切割位點以及多種克隆選項的組合。
在對照實驗中，CL7對溶解度或表達無負面影響。實際上，CL7改善了在無標簽的大腸桿菌中表達時原本不溶的蛋白質的表達水平和溶解度。當用CL7標簽表達時，幾種臨床和治療上相關的蛋白質從不溶部分轉移到可溶部分。純化變性表達的蛋白質不需要變性劑或從包涵體重新折疊。
Im7樹脂由CL7的結合伴侶Im7固定在瓊脂糖樹脂上組成。由于Im7和CL7之間具有高度特異性的親和力，脫靶樹脂的結合極少。具有35-40 mg / mL的高樹脂結合能力，可以捕獲大量CL7標記的蛋白。Im7結構域具有很高的彈性，使用Gdn-HCl可使樹脂再生并重復使用多達100次。
蛋白酶對于從Im7樹脂柱上洗脫目標蛋白至關重要。
TriAltus純化我們自己的SUMO和PSC蛋白酶，由于它們的超高純度，它們具有很高的活性。TriAltus提供的兩種蛋白酶裂解速度都更快，并且比競爭對手的產(chǎn)品便宜。
例如，如果將60-80 mg的蛋白質與5 mL色譜柱結合，則流速為0.2 mL / min的20 mL洗脫緩沖液中的1 mg蛋白酶將僅在1.5-2小時內(nèi)洗脫蛋白質。少量的蛋白酶是如此稀薄，以至于可能不需要將其去除。但是，如果需要，可以使用用于SUMO的His柱和用于PSC的GST進行拋光步驟。
SUMO蛋白酶用于洗脫N末端標記的蛋白。它是一種高度特異性的酶，可識別SUMO切割位點的三級結構，并且在切割后不留下氨基酸殘基。它的特異性也使其裂解速度比PSC快。1 ug SUMO可以在30分鐘內(nèi)裂解2 mg底物96％，在40分鐘內(nèi)裂解99％。
PSC蛋白酶用于切割N或C末端標記的蛋白。它也是高效的：20 ug PSC將在40分鐘內(nèi)以91％的比例裂解2 mg底物，在60分鐘內(nèi)以99％的比例裂解。
CL7和Im7的鹽獨立性和高度特異性的結合親和力使其可以實現(xiàn)簡單明了的方案。CL7不是在一步中使用His-trap，而是在隨后使用特殊標簽精制蛋白質，而是在一個色譜步驟中實現(xiàn)了超高純度。
市場上的每種蛋白質純化系統(tǒng)都可以通過其在兩個參數(shù)下的性能來表征：產(chǎn)量和純度。CL7 / Im7系統(tǒng)在兩個方面都優(yōu)于His-tag和special標簽。
TriAltus開發(fā)了一種用于高粘合力樹脂的高效偶聯(lián)方法。Im7樹脂的結合能力在35-40 mg / mL范圍內(nèi)。這遠遠優(yōu)于特殊標簽的樹脂，以及在用于His-trap的Ni柱的頂端。
純度取決于蛋白質純化系統(tǒng)對未標記的細胞成分的敏感性。雜質分為兩類：基于標記的靶蛋白/細胞組分相互作用的雜質，以及由于細胞組分與色譜柱結合的配體的非特異性結合而產(chǎn)生的雜質。
在高鹽濃度緩沖液的存在下，CL7與Im7的結合不會受到干擾。較高的鹽緩沖液可有??效地在純化過程中盡早去除雜質，從而獲得干凈的最終產(chǎn)品。標簽對約0.2-0.3 M的鹽濃度敏感，導致一步層析后純度低。
CL7和Im7彼此高度特定。這樣可以防止標簽或配體與細胞成分（例如DNA和其他蛋白質）之間發(fā)生非特異性相互作用。IMAC系統(tǒng)易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結合。
高耐鹽性和高特異性結合這兩個因素的結合，可產(chǎn)生如此高的純度，以至于CL7 / Im7系統(tǒng)僅需一個色譜步驟即可。
ttRNAP（Thermus嗜熱菌聚合酶）是一個大的?400 kDa的蛋白質用5個亞基（α 2 ββ'ω）和4個結合位點。傳統(tǒng)上，純化需要5個連續(xù)的色譜步驟才能獲得足夠高的純度以實現(xiàn)高活性。蛋白質的純度與其活性直接相關。將細胞裂解液加載到1.5 M鹽緩沖液中是一步純化的關鍵。CL7標簽附著在最大的 β'亞基上， 不會干擾亞基組裝。
Cas9是CRISPR技術的關鍵組成部分。Cas9活性與其純度直接相關，但通常需要4-5個色譜步驟才能達到所需的純度。當Cas9被CL7標記并裝載在1.5 M鹽緩沖液中時，在一個純化步驟中可以實現(xiàn)99％的純度。該酶在體內(nèi)和體外試驗中均顯示高活性。
YidC是約32 kDa的細菌膜整合酶。*，膜蛋白難以純化，因為與細胞成分發(fā)生疏水性接觸會造成污染。由于His-tag非特異性結合至其色譜柱，因此在純化的一個步驟后會存在大量雜質。CL7對Im7的特異性將這些影響降至低值，使純度高達99％。
GCSF，hGH和IFN-α是FDA批準的三種生物制劑。每個都有兩個內(nèi)部半胱氨酸橋，當在沒有標簽的大腸桿菌中表達時通常不溶。純化不溶蛋白通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個色譜步驟。CL7增強了蛋白質的表達，穩(wěn)定性和折疊性，因此它們不再表達為包涵體。
