chondrex膠原酶簡(jiǎn)介

Cat# 5002 - 重組人 MMP-13（截?cái)嘈停?- 處于缺貨狀態(tài)，直至未來(lái)通知。給您帶來(lái)的不便，我們深表歉意。

膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 家族的成員，這是一組參與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 和結(jié)締組織的生理和病理更新的蛋白酶。MMP 可以根據(jù)其報(bào)告的底物特異性（膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)素）和結(jié)構(gòu)（膜型 MMP）進(jìn)行分組。膠原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13）可以特異性降解天然纖維狀膠原蛋白（I、II、III、VII 和 X 型）在其定型三螺旋結(jié)構(gòu)域中，以及變性膠原蛋白（明膠）。然而，底物特異性因膠原酶而異。膠原酶在健康組織中的表達(dá)通常較低，但在炎癥條件、惡性組織和其他產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子環(huán)境的病理?xiàng)l件下會(huì)升高。因此，膠原酶是影響軟骨組織的疾病的有趣治療靶點(diǎn)。

為了研究蛋白酶對(duì)天然 I 型膠原蛋白和 II 型膠原蛋白底物的活性，Chondrex, Inc. 提供了快速膠原酶活性測(cè)定試劑盒以及 細(xì)菌膠原酶活性測(cè)定試劑盒。通過(guò)使用天然形式的膠原蛋白作為底物，這些測(cè)定可以排除其他 MMP 的酶活性，因?yàn)橹挥心z原酶可以切割天然形式的纖維狀膠原蛋白。此外，MMP-13 Inhibitor Activity Assay Kit適用于評(píng)估 MMP-13 抑制劑的功效。 

Chondrex, Inc. 還提供全長(zhǎng)潛伏型重組人 MMP-8（貨號(hào) 5001）以及截短的重組人 MMP-13（貨號(hào) 5002），它們是使用 I 型膠原蛋白進(jìn)行膠原酶活性測(cè)定的理想?yún)⒖?Cat# 4001) 和 II 型膠原蛋白 (Cat# 4002) 底物。

膠原酶檢測(cè)試劑盒

膠原酶底物

膠原酶 (MMP)

快速膠原酶活性測(cè)定試劑盒

膠原酶活性快速檢測(cè)試劑盒利用重組人中性粒細(xì)胞前膠原酶 (MMP-8) 作為參考膠原酶，以及兩種類型的膠原酶激活劑（APMA 和胰蛋白酶）。Cat#3001 使用 FITC 標(biāo)記的牛 I 型膠原蛋白，而 Cat#3002 使用 FITC 標(biāo)記的 II 型膠原蛋白作為膠原酶底物。使用這些熒光底物可以實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng)底物凝膠分析快 10 倍的反應(yīng)和更短的工作時(shí)間（約 2 小時(shí)）。每個(gè)歸類為膠原酶的 MMP 都可以切割天然形式的纖維狀膠原蛋白。然而，它們對(duì)膠原蛋白類型的親和力不同：MMP-1 更容易降解 III 型膠原蛋白，MMP-8 更容易降解 I 型膠原蛋白，而 MMP-13 優(yōu)先降解 II 型膠原蛋白。鑒于這些差異，在選擇 MMP 活性檢測(cè)方法時(shí)，重要的是要考慮 MMP 的底物特異性。

下面的圖 1提供了有關(guān)這些試劑盒中使用的檢測(cè)系統(tǒng)的更多信息。膠原酶會(huì)在 N 端切割膠原蛋白。 

這些 FITC 膠原底物以及參考 MMP 酶可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)。

圖1?？焖倌z原酶活性測(cè)定試劑盒程序的一般概述。有關(guān)更多信息，請(qǐng)參閱試劑盒協(xié)議。 

激活參考 MMP* 和樣品 MMP 是該檢測(cè)中最關(guān)鍵的步驟之一。APMA 是潛伏膠原酶的通用激活劑。然而，樣品中可能含有膠原酶抑制劑（例如 α 2 巨球蛋白、TIMPs），可以阻止 APMA 的反向激活。因此，對(duì)于這些樣品，胰蛋白酶也被用作活化劑。有關(guān)膠原酶活性測(cè)定樣品制備的更多信息，請(qǐng)聯(lián)系我們。 

細(xì)菌膠原酶活性檢測(cè)試劑盒

我們對(duì)細(xì)菌膠原酶的了解大部分來(lái)自使用從溶血梭菌中發(fā)現(xiàn)的（細(xì)菌或哺乳動(dòng)物來(lái)源的）第一種膠原酶的實(shí)驗(yàn). 基于這些研究，細(xì)菌膠原酶根據(jù)其反應(yīng)性分為兩類。I類膠原酶對(duì)膠原蛋白活性強(qiáng)，對(duì)合成分子活性弱。II 類膠原酶與合成肽反應(yīng)強(qiáng)烈，但與膠原蛋白反應(yīng)較弱。然而，自從進(jìn)行這些分類以來(lái)，已經(jīng)鑒定了幾種其他類型的細(xì)菌膠原酶。在病理學(xué)上，細(xì)菌膠原酶是許多病原菌的重要毒力因子，主要負(fù)責(zé)降解宿主 ECM 并為細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖提供生態(tài)位 (1)。有趣的是，溶組織梭菌膠原酶已用于治療 Dupuytren 病和佩羅尼病 (2,3) 患者。

細(xì)菌膠原酶活性測(cè)定試劑盒利用溶組織梭菌膠原酶作為參照，并使用 FITC 標(biāo)記的可溶性牛 I 型膠原底物。與基質(zhì)凝膠分析和基于放射性標(biāo)記的膠原蛋白的分析相比，該分析系統(tǒng)提供了更快的反應(yīng)時(shí)間和更高的靈敏度。使用該試劑盒可以運(yùn)行大約 100 個(gè)膠原酶活性測(cè)定和/或膠原酶抑制劑測(cè)定樣品。
該試劑盒類似于用于哺乳動(dòng)物 MMP（膠原酶）的快速膠原酶活性檢測(cè)試劑盒，但有幾個(gè)主要區(qū)別。與哺乳動(dòng)物 MMP 不同，細(xì)菌膠原酶會(huì)將膠原蛋白*降解為變性的肽片段。因此，彈性蛋白酶消化對(duì)于該測(cè)定是必要的。此外，細(xì)菌檢測(cè)通常已經(jīng)以其活性形式存在，因此不需要激活步驟。 
細(xì)菌膠原酶活性檢測(cè)試劑盒是檢測(cè) I 類膠原酶活性以及評(píng)估 I 類膠原酶抑制劑的理想選擇。有關(guān)不同協(xié)議的更多信息，請(qǐng)參閱試劑盒協(xié)議。 

酶活性的計(jì)算

膠原酶活性試劑盒包括參考膠原酶，但是樣品中的酶活性不能像在 ELISA 中那樣使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。相反，膠原酶活性必須計(jì)算為單位/分鐘/毫升，以便在標(biāo)準(zhǔn)和樣品之間進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋容^（圖 2）。

圖2。MMP-8 活性曲線示例。A) 使用 FITC I 型膠原蛋白作為底物的 MMP-8 活性劑量反應(yīng) - 不同量（2.5 – 10 µl）的參考 MMP-8（100 單位/毫升）在 35 ℃與 100 µg FITC I 型膠原蛋白反應(yīng)°C 60 分鐘。加入 10 µl Enhancer 后，將混合物在 35°C 下進(jìn)一步孵育 10 分鐘。B)使用 FITC-I 型膠原蛋白作為基質(zhì)的 MMP-8 活性時(shí)間 - 2.5 ml MMP-8（100 單位/ml）與 100 µg FITC-I 型膠原蛋白在 35°C 下反應(yīng) 90 分鐘。

1 單位的膠原蛋白溶解活性定義為每分鐘裂解 1 µg 膠原蛋白（1 膠原蛋白溶解單位 = 1 µg/分鐘）。由于該試劑盒使用 100 µg 膠原蛋白作為底物，因此可以使用以下公式計(jì)算溶膠原活性：

圖3。在 Chondrex, Inc. 的膠原酶活性測(cè)定試劑盒中計(jì)算溶膠原活性的方程式。FI sample :樣品的熒光強(qiáng)度；FI空白: 空白 FI控制的熒光強(qiáng)度 : 控制的熒光強(qiáng)度

該試劑盒的檢測(cè)靈敏度受反應(yīng)（孵育）時(shí)間的影響很大。更長(zhǎng)的孵育時(shí)間會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。然而，由于其他蛋白酶降解或變性膠原蛋白片段，過(guò)度孵育會(huì)增加背景信號(hào)。此外，反應(yīng)時(shí)間不足（10 分鐘或更短）可能會(huì)影響檢測(cè)的重現(xiàn)性。推薦的孵育時(shí)間為一小時(shí)；但是，必須針對(duì)您的樣品優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。測(cè)定靈敏度可以通過(guò)比較樣品的熒光強(qiáng)度 (FI) 和空白的 FI 來(lái)確定。為了獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，樣品的 FI 應(yīng)至少比空白的 FI 高 1.5 倍。例如，如果空白 FI 為 1000，則樣品 FI 必須高于 1500 才能獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。  

測(cè)定溫度也會(huì)影響測(cè)定靈敏度。一旦膠原蛋白熱變性（天然膠原蛋白為 40°C，膠原酶裂解的膠原蛋白為 35°C），由于彈性蛋白酶消化變性膠原蛋白，樣品結(jié)果可能被高估。此外，在選擇底物時(shí)，膠原底物的酶特異性是一個(gè)重要的考慮因素。 

FITC 標(biāo)記的 I 型和 II 型膠原蛋白

FITC 標(biāo)記的牛 I 型和II 型膠原蛋白（以 1:1 的比例結(jié)合）是檢查膠原酶活性的底物。為了最大限度地減少 MMP（膠原酶）測(cè)定中的背景值，這些標(biāo)記的底物已制備為不含端肽。此外，非特異性結(jié)合膠原蛋白的 FITC 已通過(guò)離子交換色譜法去除。

FITC 標(biāo)記的膠原蛋白也可用于為原代細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)建支架或建立細(xì)胞培養(yǎng)。如果以這種方式使用，則可以通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中降解的 FITC 膠原蛋白的 FI（520 nm 發(fā)射/490 nm 激發(fā)）來(lái)確定細(xì)胞的膠原酶活性。然而，培養(yǎng)基中存在的蛋白質(zhì)和染料可能會(huì)導(dǎo)致 FI 猝滅。優(yōu)化檢測(cè)和培養(yǎng)條件有助于確保一致和可靠的結(jié)果。

出于這個(gè)原因，Chondrex, Inc. 建議在創(chuàng)建細(xì)胞培養(yǎng)支架時(shí)使用高濃度的 FITC 膠原蛋白。請(qǐng)與我們聯(lián)系以獲取更多信息。  

Chondrex, Inc. 還提供許多其他等級(jí)的純化膠原蛋白，用于各種實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp;

MMP-13 抑制劑檢測(cè)試劑盒

MMP-13（膠原酶 3）是一種最初在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶 (4)。隨后，MMP mRNA 分析顯示骨關(guān)節(jié)炎 (OA) 軟骨細(xì)胞 (5-7) 以及多種惡性腫瘤類型 (8) 中 MMP-13 的表達(dá)水平增加。在生理上，MMP-13 主要在胚胎發(fā)育 (9,10) 和傷口愈合 (11,12) 期間發(fā)揮作用。已觀察到軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中 MMP-13 的產(chǎn)生被炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素 17 (IL-17)、IL-1、腫瘤壞死因子 α (TNF-α)和制瘤素 M (13- 15)。天然存在的金屬蛋白酶組織抑制劑 (TIMP) 在 MMP 活性的調(diào)節(jié)中也起著關(guān)鍵作用 (16)。

鑒于 MMP-13 傾向于降解 II 型膠原蛋白，它與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) 和 OA 中的軟骨破壞有關(guān)。因此，幾種 MMP-13 抑制劑已在小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中作為治療化合物進(jìn)行了測(cè)試 (17)。事實(shí)上，已經(jīng)開(kāi)發(fā)并廣泛研究了幾種人為的 MMP 抑制劑（主要是鋅螯合劑，如 batimastat 和 marimastat，它們可阻斷 MMP 的催化位點(diǎn)）作為多種疾病的治療劑。然而，由于嚴(yán)重和全身性的副作用，它們?cè)谂R床試驗(yàn)中都失敗了 (18)。最近，新類別的更具選擇性的 MMP 抑制劑（例如基于單克隆抗體的抑制劑和工程蛋白）作為癌癥和 OA 的治療選擇引起了人們的興趣。 

Chondrex, Inc. 的MMP-13 Inhibitor Assay Kit 提供了一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)篩選和評(píng)估實(shí)驗(yàn)性 MMP-13 和其他 MMP 抑制劑的功效。使用截短的重組人 MMP-13 (rhMMP13) 和蛋白酶抑制劑作為參考，您可以監(jiān)測(cè)合成熒光肽底物*的裂解。只需使用任何感興趣的實(shí)驗(yàn)抑制劑化合物代替試劑盒提供的蛋白酶抑制劑（目錄號(hào) 30046）來(lái)評(píng)估化合物的抑制潛力。 

*底物不含膠原三螺旋，因此對(duì)非膠原蛋白水解蛋白酶敏感。

圖 4 - 產(chǎn)生膠原酶的樹(shù)突細(xì)胞：  由含有 IL-1 的中性粒細(xì)胞提取物刺激的大鼠滑膜細(xì)胞觸發(fā)成纖維細(xì)胞向樹(shù)突細(xì)胞的形態(tài)變化。

重組人 MMP-8（膠原酶 2）

MMP-8（也稱為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶）是一種由活化的中性粒細(xì)胞釋放的膠原酶，可優(yōu)先降解 I 型膠原蛋白。MMP-8 蛋白水解活性被 TIMP-1 和 TIMP-2 抑制。與許多其他 MMP 不同，MMP-8 的功能似乎可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移 (19,20) 以及實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型 (21)。在分析生理和病理?xiàng)l件下的 MMP 動(dòng)態(tài)時(shí)，Chondrex, Inc. 的重組人 MMP-8是一種有用的參考膠原酶。 

在測(cè)定膠原酶活性或評(píng)估 MMP/膠原酶抑制劑（如 TIMPS）時(shí)，最關(guān)鍵的步驟之一是激活潛在的膠原酶。Chondrex, Inc. 的重組人 MMP-8 是一種全長(zhǎng)、潛伏的膠原酶，可用于此目的。此外，Cat# 3001 可以使用 APMA 激活，因此也可用于評(píng)估 MMP（膠原酶）抑制劑。 

重組人 MMP-13（膠原酶 3），截短

MMP-13 具有多種生理作用（骨代謝、傷口愈合）以及多種病理狀況（腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 (22)、骨關(guān)節(jié)炎 (23)）。重組人膠原酶原 MMP-13的活性形式（從 C 端截?cái)啵┛捎糜谕ㄟ^(guò)使用熒光合成肽作為底物來(lái)研究抑制劑。然而，重要的是要注意這種截短形式的 MMP-13 不能消化天然膠原蛋白，因?yàn)樗话z原蛋白結(jié)合基序。

胰蛋白酶活性測(cè)定試劑盒

胰蛋白酶由胰腺產(chǎn)生，在促進(jìn)小腸中的蛋白質(zhì)消化和營(yíng)養(yǎng)吸收方面起著關(guān)鍵作用。它還通過(guò)控制腸腔中的殺微生物劑濃度和維持上皮屏障的完整性來(lái)幫助調(diào)節(jié)胃腸道免疫反應(yīng) (24,25)。由于這些功能，胰蛋白酶被廣泛用于蛋白質(zhì)或肽相關(guān)研究，以合成和測(cè)序肽、維持培養(yǎng)的細(xì)胞和消化蛋白質(zhì) (26)。 

Chondrex, Inc. 提供了一種顯色胰蛋白酶活性測(cè)定試劑盒，它使用 Boc-Gln-Ala-Arg-pNA 底物在短短 15 分鐘內(nèi)測(cè)量胰蛋白酶樣酶活性。胰蛋白酶裂解底物 Arg 中的羰基，釋放出對(duì)硝基苯胺 (pNA)，產(chǎn)生黃色并可使用光密度進(jìn)行量化 (27)。該試劑盒適用于胰蛋白酶和任何裂解底物的蛋白酶/肽酶。